前言?

人類(lèi)自然殺傷細(xì)胞(NK) 占所有循環(huán)淋巴細(xì)胞的15%。NK細(xì)胞發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，主要與殺死感染的微生物和惡性轉(zhuǎn)化的同種異體和自體細(xì)胞有關(guān)。NK細(xì)胞表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞毒性，無(wú)需事先致敏和產(chǎn)生細(xì)胞因子以及調(diào)節(jié)各種免疫反應(yīng)的趨化因子。人外周血NK細(xì)胞可分為CD56bright和CD56dim兩大類(lèi)。CD56brightNK細(xì)胞通常被認(rèn)為是低細(xì)胞毒性的細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞，而CD56dimNK細(xì)胞則具有潛在的細(xì)胞毒性。由于NK細(xì)胞能夠識(shí)別和分解腫瘤細(xì)胞，以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療領(lǐng)域已經(jīng)到了一個(gè)激動(dòng)人心的關(guān)頭。

嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細(xì)胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。它的細(xì)胞外抗原結(jié)合域通常為單鏈抗體（scFv），可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原。細(xì)胞內(nèi)激活的信號(hào)結(jié)構(gòu)域，如CD28、4-1BB（CD137）和OX40，通常起到觸發(fā)免疫細(xì)胞激活和殺傷的作用。表達(dá)CAR的T細(xì)胞能迅速識(shí)別腫瘤表面抗原，進(jìn)而裂解腫瘤細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞免疫治療在治療急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）、慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）和淋巴瘤等血液腫瘤方面取得了巨大的成就。

【資料圖】

然而盡管CAR-T細(xì)胞免疫治療技術(shù)發(fā)展迅速，但在臨床應(yīng)用中仍存在一些不足，例如在實(shí)體瘤的治療中顯示出很低的療效；此外，大多數(shù)的CAR-T細(xì)胞免疫療法需要自體過(guò)繼細(xì)胞移植，因?yàn)槌翘幚鞨LA屏障，否則異基因T細(xì)胞可能導(dǎo)致移植物抗宿主?。℅VHD）；另外，CAR-T細(xì)胞免疫治療可能會(huì)產(chǎn)生一些副作用，對(duì)患者的生命造成危害，如細(xì)胞因子釋放綜合征。最新的研究表明，表達(dá)CAR的NK細(xì)胞可能會(huì)克服CAR-T細(xì)胞的上述缺陷，并顯示出顯著的抗腫瘤作用。CAR-NK細(xì)胞在腫瘤的免疫治療中展現(xiàn)出廣闊的前景。

CAR結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)

NK細(xì)胞上表達(dá)的功能性CAR分子由三部分組成：胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)的信號(hào)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域由一個(gè)信號(hào)肽和識(shí)別抗原的單鏈抗體片段（scFv）組成，一段鉸鏈區(qū)將這個(gè)結(jié)構(gòu)連接到跨膜區(qū)，它也在細(xì)胞內(nèi)連接到包含激活信號(hào)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。成功的CAR設(shè)計(jì)是通過(guò)仔細(xì)的設(shè)計(jì)和功能測(cè)試相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

載體骨架和啟動(dòng)子

載體骨架包含表達(dá)CAR所需的所有元件，如啟動(dòng)子、polyA信號(hào)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控片段。

啟動(dòng)子的選擇直接影響到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。目前，對(duì)不同啟動(dòng)子在NK細(xì)胞系中的CAR表達(dá)和功能的比較只有一次報(bào)道，而對(duì)原代NK細(xì)胞沒(méi)有比較數(shù)據(jù)。就這一次單個(gè)報(bào)告來(lái)看，還不能確定CAR-NK細(xì)胞的最佳啟動(dòng)子。

目前關(guān)于CAR-NK細(xì)胞的報(bào)道顯示，多種啟動(dòng)子被用于驅(qū)動(dòng)CAR的表達(dá)，無(wú)論是細(xì)胞系來(lái)源的還是原代NK細(xì)胞。在原代CAR-NK和CAR-NK細(xì)胞系中，病毒啟動(dòng)子（CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比組成性活性啟動(dòng)子（如EF1α、CMV和PGK）更常用。

信號(hào)肽

在信號(hào)肽中存在著巨大的異質(zhì)性，這直接轉(zhuǎn)化為不同水平的蛋白質(zhì)分泌效率。對(duì)于CAR-NK和CAR-T細(xì)胞，還沒(méi)有確定最佳信號(hào)肽的比較研究。目前，CD8a-SP是原代NK細(xì)胞最常用的信號(hào)肽序列（16%，71%的研究中未公布）和NK細(xì)胞系的免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號(hào)肽（29%）。

單鏈抗體

單鏈抗體片段是CAR的腫瘤抗原結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域?qū)Q定CAR-NK細(xì)胞的特異性和功能。

由于單鏈抗體不是抗體的天然形式，因此重鏈和輕鏈的順序是人工確定的。到目前為止，對(duì)于CAR-NK設(shè)計(jì)，大多數(shù)更喜歡VH-VL方向，而不是VL-VH方向。Fujiwara等人證明重鏈和輕鏈的順序不影響T細(xì)胞上抗KDR CAR的表達(dá)水平。

此外，細(xì)胞可以配備多個(gè)單鏈抗體，從而擴(kuò)大CAR效應(yīng)細(xì)胞的抗原識(shí)別能力。在這里，有多種選擇：CARs可以用雙元件的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)兩個(gè)CAR結(jié)構(gòu)的表達(dá)；或者將兩個(gè)單鏈抗體融合在一個(gè)結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生串聯(lián)單鏈抗體的“單柄”CAR。雖然這些技術(shù)已用于生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞，但CAR-NK細(xì)胞仍未知。

目前大多數(shù)臨床CAR-T細(xì)胞試驗(yàn)都使用了來(lái)自小鼠抗體的單鏈抗體，這增加了抗小鼠IgG細(xì)胞宿主抗移植物病的風(fēng)險(xiǎn)，這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)人源化或篩選全人抗體避免。然而不幸的是，由于這些CAR受體的嵌合特性，即使是人源化的單鏈抗體也可能誘導(dǎo)宿主抗獨(dú)特型免疫反應(yīng)。幸運(yùn)的是，在迄今為止數(shù)量有限的CAR-NK臨床試驗(yàn)中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與抗CAR免疫反應(yīng)相關(guān)的重大副作用。

連接區(qū)

重鏈和輕鏈之間的連接區(qū)有助于穩(wěn)定單鏈抗體的構(gòu)象，過(guò)短會(huì)導(dǎo)致多聚體的形成，過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致水解或降低VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)聯(lián)。對(duì)于CAR-NK細(xì)胞，五肽GGGGS的多聚體應(yīng)用最為廣泛，通常為3個(gè)重復(fù)。另一個(gè)旨在增強(qiáng)蛋白水解穩(wěn)定性的連接體是Whitlow“218”連接體：GSTGSGSKPGSGEGSTKG。

目前，雖然大多數(shù)CAR-NK研究沒(méi)有提供連接細(xì)節(jié)，但已有的研究報(bào)道中，有22項(xiàng)使用了G4S連接，有2項(xiàng)應(yīng)用了218連接。

鉸鏈區(qū)

鉸鏈區(qū)是連接單鏈抗體單位和跨膜結(jié)構(gòu)域的CAR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)區(qū)，它通常維持效應(yīng)細(xì)胞中穩(wěn)健的CAR表達(dá)和活性所需的穩(wěn)定性。大多數(shù)CAR-NK構(gòu)建使用CD8α或CD28胞外結(jié)構(gòu)域的衍生物或基于IgG的鉸鏈區(qū)。

鉸鏈區(qū)的類(lèi)型和長(zhǎng)度對(duì)CAR的功能活動(dòng)有重要影響。但是目前大多數(shù)信息全來(lái)自CAR-T領(lǐng)域，能否直接轉(zhuǎn)化為CAR-NK還有待證明。

在CD28和CD8α鉸鏈區(qū)之間的直接比較中，發(fā)現(xiàn)CD28更有可能促進(jìn)CAR分子的二聚化，因此，CD28鉸鏈區(qū)的CAR產(chǎn)生的激活刺激更強(qiáng)。雖然這可能是有益的，但也可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的副作用。

IgG為基礎(chǔ)的鉸鏈區(qū)也廣泛應(yīng)用于CAR結(jié)構(gòu)?；贗gG鉸鏈區(qū)的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是結(jié)構(gòu)的靈活性，該結(jié)構(gòu)通常由IgG1或IgG4的FC部分或Fc部分的CH2/CH3結(jié)構(gòu)域組成。鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)度可以調(diào)節(jié)以適應(yīng)抗原識(shí)別，但研究發(fā)現(xiàn)，間隔區(qū)越短，細(xì)胞因子的產(chǎn)生越高，CAR-T細(xì)胞增殖越快，體內(nèi)持久性和抗腫瘤效果越好。

對(duì)于CAR-NK細(xì)胞，大多數(shù)研究在原代NK細(xì)胞（16/35）和CAR-NK細(xì)胞系（41/72）中均采用CD8α鉸鏈區(qū)。其它使用的鉸鏈區(qū)包括CD28、IgG Fc結(jié)構(gòu)域和DAP12。

跨膜結(jié)構(gòu)域

跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域連接CAR的胞外結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)激活信號(hào)結(jié)構(gòu)域，CAR-NK最常用的TM部分來(lái)自CD3ζ、CD8和CD28，但其他如NKG2D、2B4、DNAM1也有被使用。

TM結(jié)構(gòu)域的選擇影響了CAR結(jié)構(gòu)在細(xì)胞功能上的活化程度。通常在NK細(xì)胞上表達(dá)的分子如DNAM-1、2B4和NKG2D的TM會(huì)導(dǎo)致更多的CD107a脫顆粒和更高的細(xì)胞毒性，因此，TM的具體來(lái)源將決定CAR-NK的活性。

TM結(jié)構(gòu)域的一個(gè)重要方面是，最佳TM區(qū)域應(yīng)遵循T細(xì)胞或NK細(xì)胞上跨膜蛋白的蛋白質(zhì)自然取向（N端到C端順序）。NKG2D雖然是一種強(qiáng)大的NK細(xì)胞激活劑，然而，天然NKG2D具有C端到N端的跨膜區(qū)。

目前，CD8α和CD28修飾的TM在原代CAR-NK細(xì)胞中最常見(jiàn)，而CD28是CAR-NK細(xì)胞系的首選TM區(qū)域。

CAR-NK激活信號(hào)

CAR的細(xì)胞內(nèi)激活信號(hào)的數(shù)量決定了其屬于哪一“代”CAR。

第一代CAR-NK細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞一樣，只含有CD3ζ信號(hào)。第二代和第三代CAR-NK分別攜帶一個(gè)和兩個(gè)額外的共刺激信號(hào)，共刺激分子通常來(lái)源于CD28家族（CD28和ICOS）、TNFR家族（4-1BB、OX40和CD27）或SLAM相關(guān)受體家族（2B4）。到目前為止，唯一公布的CAR-NK臨床試驗(yàn)采用了第二代CAR-NK構(gòu)建，該構(gòu)建通過(guò)加入IL-15表達(dá)和誘導(dǎo)Caspase9增強(qiáng)活性。

目前大多數(shù)CAR結(jié)構(gòu)依賴(lài)于CD3ζ鏈信號(hào)域，強(qiáng)烈的激活信號(hào)對(duì)于誘導(dǎo)有效的抗腫瘤反應(yīng)很重要，但也可能導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞的快速衰竭。因此，共刺激域的組合可用于校準(zhǔn)所需的免疫細(xì)胞反應(yīng)。與基于4-1BB的 CARs相比，基于CD28的CARs表現(xiàn)出更快的效應(yīng)器特征，誘導(dǎo)更高水平的IFN-γ、顆粒酶B、TNF-α。然而，這種強(qiáng)烈的共刺激信號(hào)也會(huì)導(dǎo)致活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（AICD）。

相比較，4-1BB-CD3ζ信號(hào)優(yōu)先誘導(dǎo)記憶相關(guān)基因和持續(xù)的抗腫瘤活性。原因可能是4-1BB結(jié)構(gòu)域改善了CD28結(jié)構(gòu)域引起的T細(xì)胞耗竭。

如上圖所示，在CAR-NK細(xì)胞系和原代CAR-NK細(xì)胞的研究中，CD3ζ幾乎被普遍用作主要的激活域，其中大約一半攜帶一個(gè)額外的激活域，通常添加4-1BB或CD28。至于第三代結(jié)構(gòu)，CD28/4-1BB/CD3ζ的組合是最常用的。

CAR的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)載體

隨著基因修飾技術(shù)的進(jìn)步，許多方法被用于產(chǎn)生CAR-NK。兩種主要方法是病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)（使用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒），或轉(zhuǎn)染裸質(zhì)粒DNA、轉(zhuǎn)座酶DNA介導(dǎo)的整合以及mRNA電轉(zhuǎn)。

慢病毒

慢病毒能夠高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)周期性和非周期性細(xì)胞，在基因治療領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。迄今為止，已有14篇關(guān)于原代CAR-NK細(xì)胞和44篇關(guān)于CAR-NK細(xì)胞系的研究成功使用慢病毒作為載體。

在臨床前研究中，21項(xiàng)研究使用了第二代病毒，6項(xiàng)研究使用了第三代慢病毒來(lái)產(chǎn)生表達(dá)CAR的NK細(xì)胞系（17個(gè)未知）。在原代CAR-NK細(xì)胞研究中，5項(xiàng)研究使用了第三代慢病毒，7項(xiàng)研究使用了第二代慢病毒載體（2個(gè)未知）。

逆轉(zhuǎn)錄病毒

幾十年來(lái)，逆轉(zhuǎn)錄病毒一直被用作基因治療載體。迄今為止，有20項(xiàng)使用CAR-NK細(xì)胞系的研究和15使用原代NK細(xì)胞的研究應(yīng)用了逆轉(zhuǎn)錄病毒。最近的一項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)中，由逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD19 CAR-NK細(xì)胞治療CD19+非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病。在這項(xiàng)研究中，73%的患者有響應(yīng)，8名患者中有7名獲得完全緩解。此外，在所有劑量水平下，CAR-NK輸注后30天內(nèi)反應(yīng)迅速。經(jīng)過(guò)一年的隨訪，仍然可以檢測(cè)到擴(kuò)增的CAR-NK細(xì)胞。輸注后，外周血中的CAR-NK DNA拷貝數(shù)保持穩(wěn)定達(dá)一年之久，這些結(jié)果首次表明逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-NK細(xì)胞可以在體內(nèi)長(zhǎng)期存活。

不同種類(lèi)的逆轉(zhuǎn)錄病毒被用來(lái)產(chǎn)生CAR-NK細(xì)胞。與γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒相比，RD114α逆轉(zhuǎn)錄病毒在原代NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率上更高。盡管使用不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以在NK細(xì)胞中獲得長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的CAR表達(dá)，但逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的安全性仍然是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題，尤其是與更安全的慢病毒相比。

mRNA電穿孔

電穿孔CAR編碼mRNA是一種快速、有效但是作用短暫的一種方法。迄今為止，有9個(gè)關(guān)于CAR-NK細(xì)胞系和11個(gè)原代CAR-NK細(xì)胞研究使用了mRNA電穿孔。

一般來(lái)說(shuō)，擴(kuò)增或活化的NK細(xì)胞的mRNA轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)高于新鮮分離的NK細(xì)胞。由于mRNA的合成符合GMP的規(guī)定，并且電穿孔可以在潔凈室中進(jìn)行，因此通過(guò)mRNA電穿孔產(chǎn)生符合GMP的CAR-NK是可行的。然而，這種方法的主要缺點(diǎn)是CAR表達(dá)的窗口短暫：電穿孔后，CAR-NK細(xì)胞應(yīng)在7天內(nèi)輸回患者體內(nèi)。

睡美人轉(zhuǎn)座子

基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)可以在預(yù)定的位置高效地導(dǎo)入CAR轉(zhuǎn)基因，這是傳統(tǒng)方法所不具備的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)。轉(zhuǎn)座子主要通過(guò)電穿孔導(dǎo)入NK細(xì)胞，然后通過(guò)轉(zhuǎn)座子酶整合到宿主基因組中。有兩項(xiàng)研究應(yīng)用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生CAR-NK細(xì)胞：一項(xiàng)使用NK-92-MI細(xì)胞，另一項(xiàng)研究將轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染到iPSC細(xì)胞，然后分化成NK細(xì)胞。富集后，抗間皮素CARs在iPSC衍生的NK細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá)，并在卵巢癌小鼠模型中發(fā)揮出作用。

CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9是一種強(qiáng)大的基因改造技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)依賴(lài)于將Cas9蛋白與引導(dǎo)RNA一起導(dǎo)入NK細(xì)胞。最初，這種技術(shù)被用于原代NK細(xì)胞，以破壞CD38基因，旨在防止NK細(xì)胞與daratumumab （抗CD38）聯(lián)合使用時(shí)的自相殘殺，因?yàn)镃D38在NK細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤和AML細(xì)胞上均有表達(dá)。

最近，CRISPR/Cas9被用于引入新基因。在一些采用HDR模板的研究中，使用K562-mIL-21擴(kuò)增的NK細(xì)胞獲得了超過(guò)75%的敲入效率。然而，在新鮮NK細(xì)胞中，敲入效率僅為3–16%?？偟膩?lái)說(shuō)，CRISPR/Cas9策略是一種很有前景的技術(shù)，它可以用來(lái)精確地刪除、修復(fù)或?qū)胩囟ɑ?，有望產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤NK細(xì)胞。

CAR-NK細(xì)胞免疫治療的優(yōu)勢(shì)

首先，在臨床應(yīng)用中，CAR-NK細(xì)胞免疫療法比CAR-T細(xì)胞免疫療法更安全，而且NK細(xì)胞的安全性已在一些臨床領(lǐng)域得到驗(yàn)證。例如，一些I/II期試驗(yàn)顯示，同種異體NK細(xì)胞輸注耐受性良好，不會(huì)引起GVHD和明顯的毒性。因此，NK細(xì)胞是一種適應(yīng)性更強(qiáng)的CAR載體，而不僅僅局限于自體細(xì)胞。

CAR-T細(xì)胞免疫治療的主要副作用之一是由于CAR-T細(xì)胞的持續(xù)存在而產(chǎn)生的靶向效應(yīng)。相反，CAR-NK細(xì)胞的壽命很短，幾乎不會(huì)產(chǎn)生靶向效應(yīng)。另外，NK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類(lèi)與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類(lèi)有很大不同。活躍的NK細(xì)胞通常產(chǎn)生IFN-γ和粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），而CAR-T細(xì)胞通常通過(guò)分泌促炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴。

第二，除了通過(guò)單鏈抗體識(shí)別腫瘤表面抗原來(lái)抑制癌細(xì)胞外，NK細(xì)胞還可以通過(guò)多種受體識(shí)別各種配體來(lái)抑制癌細(xì)胞，例如自然細(xì)胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM-1（CD226）。這些NK細(xì)胞受體通常識(shí)別在免疫細(xì)胞或長(zhǎng)期治療壓力下腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的應(yīng)激誘導(dǎo)配體。此外，NK細(xì)胞通過(guò)FcγRIII（CD16）誘導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性。因此，CAR-NK細(xì)胞可通過(guò)CAR依賴(lài)和NK細(xì)胞受體依賴(lài)性途徑抑制癌細(xì)胞，從而消除腫瘤抗原陽(yáng)性癌細(xì)胞或表達(dá)NK細(xì)胞受體配體的癌細(xì)胞。臨床試驗(yàn)表明，CAR-T細(xì)胞不能消除高度異質(zhì)性的癌細(xì)胞，但是CAR-NK細(xì)胞能夠有效地殺死長(zhǎng)期治療后可能改變其表型的殘留腫瘤細(xì)胞。

最后，NK細(xì)胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（HESC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSC）甚至NK-92細(xì)胞系中產(chǎn)生。NK-92細(xì)胞提供了一個(gè)均勻的細(xì)胞群，并且可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下很容易地?cái)U(kuò)大，以進(jìn)行廣泛的臨床應(yīng)用。但是，由于其腫瘤細(xì)胞系來(lái)源，必須在輸注前進(jìn)行輻照。相反，活躍的PB-NK細(xì)胞表達(dá)廣泛的受體，無(wú)需輻射即可利用，這使得它們能夠在體內(nèi)生成。來(lái)源于iPSCs或hESCs的NK細(xì)胞結(jié)合了PB-NK和NK-92細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)出與PB-NK細(xì)胞相似的表型，是一個(gè)同質(zhì)的群體。更重要的是，通過(guò)采用非病毒轉(zhuǎn)基因方法，CAR可以很容易地在人胚胎干細(xì)胞和/或iPSC來(lái)源的NK細(xì)胞中表達(dá)。

CAR-NK細(xì)胞免疫治療的臨床研究

血液瘤

臨床前研究表明，CD19-CAR-NK細(xì)胞對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤有很高的應(yīng)答率，并且易于制造，與目前的CAR-T細(xì)胞免疫療法相比，這是一個(gè)巨大的進(jìn)步。CD19-CAR修飾的NK細(xì)胞具有比CAR-T更明顯的優(yōu)勢(shì)，有望顯示出更好的抗腫瘤作用。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR-NK細(xì)胞臨床研究也針對(duì)CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有幾種針對(duì)血液惡性腫瘤的CAR-NK細(xì)胞臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

實(shí)體瘤

CAR治療的一個(gè)主要障礙是缺乏對(duì)實(shí)體瘤的療效。這是由于腫瘤灌注不良、TAA異質(zhì)性和實(shí)體瘤伴發(fā)的免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME）所致。

CAR-NK療法試圖解決這些問(wèn)題，一些臨床試驗(yàn)已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)體惡性腫瘤的治療。在實(shí)體瘤中進(jìn)展最為廣泛的CAR-NK療法包括檢查點(diǎn)分子程序性細(xì)胞死亡蛋白-1配體（PD-L1）以及常見(jiàn)的腫瘤相關(guān)抗原HER2和MUC1為靶點(diǎn)。?

PD-L1在TME和免疫抑制細(xì)胞的幾種癌癥類(lèi)型中上調(diào)。一種新的NK-92細(xì)胞系被設(shè)計(jì)成靶向PD-L1、ER保留的IL-2和高親和力CD16的CAR，稱(chēng)為PD-L1靶向haNK（t-haNK）。令人興奮的臨床前數(shù)據(jù)表明，這些細(xì)胞在體外對(duì)15種腫瘤細(xì)胞株具有特異的抗腫瘤作用，在體內(nèi)對(duì)三陰性乳腺癌、膀胱腫瘤和肺癌具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用。QUITL3.064 I期臨床試驗(yàn)（NCT04050709）目前正在進(jìn)行，PD-L1 t-haNK聯(lián)合其他藥物評(píng)估局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的安全性和有效性也在進(jìn)行中（NCT0439099）。

HER2在幾種癌癥中過(guò)度表達(dá)，如乳腺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌。HER2也在80%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)，并且與低生存率相關(guān)。因此，HER2是CAR治療的一個(gè)非常有吸引力的靶點(diǎn)。HER2-CAR-T治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤已經(jīng)顯示出這些細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到腫瘤中，但是在TME中高效應(yīng)功能的T細(xì)胞導(dǎo)致抗原丟失變體的快速選擇。ErbB2-NK-92/5.28z CAR-NK將在潛在抗原丟失的情況下保持效應(yīng)器功能，從而使過(guò)繼轉(zhuǎn)移細(xì)胞的細(xì)胞毒功能恢復(fù)到基線NK細(xì)胞的細(xì)胞毒功能。這項(xiàng)HER2-CAR-NK治療正在一項(xiàng)3+3劑量遞增I期臨床試驗(yàn)（CAR2BRAIN；NCT0338978）中。

MUC1是一種在導(dǎo)管上皮細(xì)胞上表達(dá)的高度糖基化跨膜糖蛋白，其在人類(lèi)B細(xì)胞和T細(xì)胞上的表達(dá)存在爭(zhēng)議。MUC1在多種癌癥類(lèi)型中過(guò)度表達(dá)，使其成為CAR-T治療的合適靶點(diǎn)。然而，CAR-T療法已被證明是不成功的，因?yàn)槊庖咭种频腡ME。為了規(guī)避TME介導(dǎo)的免疫抑制，CAR-NK細(xì)胞被設(shè)計(jì)表達(dá)帶有CD28和CD137信號(hào)結(jié)構(gòu)域的MUC1-CAR和截短的PD-1肽（MUC1-CAR-NK-92）。這些細(xì)胞在體外和體內(nèi)均能殺傷MUC1靶細(xì)胞。最近完成了一項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)（NCT02839954），評(píng)估了Muc1-CAR-NK-92在Muc1陽(yáng)性復(fù)發(fā)或難治性實(shí)體瘤患者中的安全性和有效性。13例PD-L1和MUC1陽(yáng)性腫瘤患者中，3名退出，9名病情穩(wěn)定，1名患者病情進(jìn)展。主要的觀察指標(biāo)是確定Muc1-CAR-NK-92細(xì)胞的毒性，值得注意的是，試驗(yàn)中沒(méi)有任何患者出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴或骨髓抑制的跡象。

CAR-NK細(xì)胞治療的挑戰(zhàn)

低持久性

在缺乏細(xì)胞因子支持的情況下，輸注細(xì)胞缺乏體內(nèi)持久性是過(guò)繼NK細(xì)胞治療的主要缺點(diǎn)之一。雖然它可能更安全的，但它也會(huì)限制NK細(xì)胞免疫治療的效果。外源性細(xì)胞因子已被證明能增加過(guò)繼性NK細(xì)胞的增殖和耐久性；然而，它們也可能導(dǎo)致不希望的副作用，包括抑制性免疫亞群的生長(zhǎng)，如Tregs。

轉(zhuǎn)移到所需的腫瘤部位

快速歸巢到腫瘤床對(duì)于過(guò)繼性細(xì)胞治療效果至關(guān)重要，并且受NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞釋放的趨化因子之間復(fù)雜相互作用的控制。然而，NK細(xì)胞歸巢到腫瘤部位的效率一直存在爭(zhēng)議，因此促使人們不斷努力去進(jìn)行改進(jìn)。

一些研究人員已經(jīng)研究了各種工程方法來(lái)改善NK細(xì)胞歸巢。例如，用編碼趨化因子受體CCR7的mRNA電穿孔NK細(xì)胞，以增加向表達(dá)趨化因子CCL19的淋巴結(jié)的移動(dòng)。用編碼CXCR2的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)表達(dá)同源配體如CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6和CXCL8的腎細(xì)胞癌腫瘤表現(xiàn)出更好的運(yùn)動(dòng)性。為了提高實(shí)體瘤患者NK細(xì)胞免疫治療的成功率，在小鼠模型中研究了幾種促進(jìn)NK細(xì)胞向腫瘤部位轉(zhuǎn)運(yùn)的新技術(shù)；然而，這些方法的有效性還需要在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

免疫抑制腫瘤微環(huán)境

TME包括免疫抑制分子、免疫抑制細(xì)胞和妨礙免疫細(xì)胞功能的不利環(huán)境，是CAR-NK細(xì)胞治療的主要障礙。TGF-β；腺苷；吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）和前列腺素E2（PGE2）是TME中發(fā)現(xiàn)的可損害NK細(xì)胞活性的免疫抑制細(xì)胞因子和代謝物。Treg細(xì)胞；調(diào)節(jié)性B細(xì)胞；髓源性抑制細(xì)胞；腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）；血小板；成纖維細(xì)胞和一些不利的代謝因素，如缺氧、酸度和營(yíng)養(yǎng)缺乏，在惡性環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致免疫抑制。

因此，研究人員正致力于開(kāi)發(fā)能夠防止某些免疫抑制作用的CAR-NK細(xì)胞。例如，通過(guò)使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除TGF-βR2基因或者阻斷NK細(xì)胞上的高親和力A2A腺苷受體。TME導(dǎo)致NK細(xì)胞耗竭的另一個(gè)重要方法是免疫檢查點(diǎn)分子。為了克服這個(gè)問(wèn)題，基因組編輯被用來(lái)消除NK細(xì)胞的檢查點(diǎn)成分，以改善其功能。

慢病毒低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

基于慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)基因修飾和傳遞的最常用的方法之一。然而，由于自然特性，NK細(xì)胞對(duì)慢病毒具有抗性，這使得基于慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)成為一個(gè)挑戰(zhàn)。為了改進(jìn)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，人們使用了各種化學(xué)物質(zhì)，例如，可以使用魚(yú)精蛋白硫酸鹽或葡聚糖去除細(xì)胞膜上的電荷。

CAR-NK細(xì)胞療法的未來(lái)展望

識(shí)別靶抗原

CARs設(shè)計(jì)中最關(guān)鍵的一步是識(shí)別高度一致表達(dá)的靶腫瘤抗原。大多數(shù)腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）也由一些健康細(xì)胞表達(dá)，因此，不可避免帶來(lái)“靶向非腫瘤”的效應(yīng)。此外，同一腫瘤的單細(xì)胞克隆中這些TAA的表達(dá)可能存在巨大差異。為了克服這個(gè)問(wèn)題，人們?cè)O(shè)計(jì)了雙特異性CAR，可以同時(shí)靶向多個(gè)抗原。

這可以通過(guò)多種方式實(shí)現(xiàn)，例如，可以同時(shí)注射針對(duì)不同抗原的不同CAR-NK細(xì)胞；或者設(shè)計(jì)一種能夠識(shí)別多種抗原的CAR，這一目標(biāo)可以通過(guò)“串聯(lián)CAR”實(shí)現(xiàn)，其中兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)連接到單個(gè)分子上，以提高免疫突觸的效率。此外，通過(guò)使用一個(gè)稱(chēng)為“雙順?lè)醋覥AR”的載體可以在同一免疫細(xì)胞上產(chǎn)生多個(gè)CAR。

提高NK細(xì)胞活性

幾個(gè)免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)和抑制NK細(xì)胞活性。這些免疫檢查點(diǎn)起到了“天然剎車(chē)”的作用，以防止自身免疫疾病或過(guò)度激活引起的免疫病理狀況。這些檢查點(diǎn)的基因缺失或阻斷可以幫助CAR-NK細(xì)胞保持過(guò)度活躍，更快地?cái)[脫癌癥和轉(zhuǎn)移。

例如，一種新的NK-92細(xì)胞系被設(shè)計(jì)成靶向PD-L1、ER保留的IL-2和高親和力CD16的CAR，稱(chēng)為PD-L1靶向haNK（t-haNK）。令人興奮的臨床前數(shù)據(jù)表明，這些細(xì)胞在體外對(duì)15種腫瘤細(xì)胞株具有特異的抗腫瘤作用，在體內(nèi)對(duì)三陰性乳腺癌、膀胱腫瘤和肺癌具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用。

另一個(gè)提高CAR-NK細(xì)胞活性的重要策略是腫瘤代謝的調(diào)節(jié)，但這一策略尚未得到應(yīng)有的重視。在缺氧條件下，腺苷是通過(guò)CD39和CD73代謝ATP產(chǎn)生的，它們參與免疫逃避，阻止NK細(xì)胞運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位，并阻止NK細(xì)胞成熟。NKG2D工程化的CAR-NK細(xì)胞在抗CD73抗體抑制后顯示出治療肺癌的良好效果。

克服免疫抑制微環(huán)境

腫瘤具有多種免疫抑制因子，如TGF-β、IL-10、PD-1或精氨酸酶。有幾種方法可以降低TGF-β的抑制作用。例如，TGF-β激酶抑制劑和NK細(xì)胞的組合被發(fā)現(xiàn)可以恢復(fù)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并且保留NKG2D和CD16的表達(dá)。此外，使用帶有細(xì)胞外TGF-β受體結(jié)構(gòu)域的混合型CARs已被發(fā)現(xiàn)在提高NK-92細(xì)胞的抗腫瘤潛能方面相當(dāng)成功。通過(guò)敲除實(shí)體瘤中的SMAD3，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性已得到增強(qiáng)。

提高安全性

提高基于CAR-NK細(xì)胞治療安全性的重要方法可能包括通過(guò)加入自殺基因或開(kāi)發(fā)雙特異性CAR分子來(lái)修飾CAR結(jié)構(gòu)，以更好地靶向腫瘤特異性抗原。

CAR-NK細(xì)胞可以以CAR依賴(lài)和CAR非依賴(lài)的方式同樣靶向腫瘤；因此，NK細(xì)胞的這一特性可以被用來(lái)發(fā)揮增強(qiáng)的腫瘤殺傷作用和開(kāi)發(fā)非信號(hào)CAR。這些非信號(hào)CAR缺乏直接殺傷信號(hào)，但通過(guò)促進(jìn)NK細(xì)胞在靶細(xì)胞上的駐留和粘附，可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的特異性殺傷。另一個(gè)有趣的策略是設(shè)計(jì)能夠調(diào)節(jié)TME的CAR-NK，這種CAR-NK被命名為“裝甲”CAR-NK細(xì)胞。這些非常特殊的CAR-NK細(xì)胞表達(dá)幾種外源基因，可以調(diào)節(jié)局部TME以防止任何有害影響。

提高可及性

為了克服實(shí)體瘤中CAR-NK細(xì)胞的可及性，可以使用幾種方法，包括局部給藥、腹腔給藥和聚焦超聲引導(dǎo)給藥。例如，在模擬人類(lèi)胸膜惡性腫瘤的原位模型中發(fā)現(xiàn)胸膜注射非常有效，其功能持續(xù)時(shí)間甚至比靜脈注射獲得的時(shí)間更長(zhǎng)。局部給予CAR免疫細(xì)胞也可能有助于減少治療劑量。

新一代的CAR-NK

一些研究小組正在探索不同的機(jī)制來(lái)有效地對(duì)抗抗原丟失和免疫抑制TME，從而將提高CAR-NK治療策略的治療壽命和療效，并可能成為下一代CAR-NK治療的支柱。

為了避免抗原逃逸，Mitwasi和他的同事開(kāi)發(fā)了一種通用型CAR（UniCAR），帶有開(kāi)關(guān)，以提高安全性和可控性。這項(xiàng)技術(shù)首先在針對(duì)E5B9的CAR-T細(xì)胞上得到驗(yàn)證，E5B9是核抗原La-SS/B的肽表位。由于在細(xì)胞表面沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種蛋白，CAR-T必須通過(guò)一種稱(chēng)為靶模塊（TM）的雙特異性分子定向到腫瘤。TMs通常以E5B9肽表位融合到抗TAA的單鏈抗體上。不同的TM可以聯(lián)合應(yīng)用，以同時(shí)針對(duì)多個(gè)TAA，誘導(dǎo)CARs反應(yīng)肽的異質(zhì)性，而不存在靶向效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

Mitwasi等人開(kāi)發(fā)了一個(gè)表達(dá)UniCAR的NK-92細(xì)胞系和一個(gè)TM，其中E5B9表位連接到IgG4主干上的抗GD2單抗。GD2在多種人類(lèi)腫瘤中高表達(dá)，是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的免疫治療靶點(diǎn)之一。以表達(dá)GD2的神經(jīng)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)的UniCAR NK-92在體外表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞毒性，已準(zhǔn)備進(jìn)一步的臨床開(kāi)發(fā)。

CAR治療面臨的另一個(gè)挑戰(zhàn)是TME。為避免免疫抑制性TME，Wang等構(gòu)建了NK-92細(xì)胞，表達(dá)由細(xì)胞外TGFβRII融合到激活受體NKG2D的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域組成的修飾CAR（TGFβRII-NKG2D，稱(chēng)為NK-92-TN）。本質(zhì)上，這種融合將免疫抑制劑TME產(chǎn)生的TGF-β傳遞的信號(hào)轉(zhuǎn)換為激活信號(hào)。體外培養(yǎng)的NK-92-TN細(xì)胞對(duì)TGF-β抑制有抵抗力，無(wú)NKG2D下調(diào)，TGF-β共培養(yǎng)后殺傷能力和IFN-γ產(chǎn)生增加。雖然體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看起來(lái)很有希望，但在體內(nèi)，NK-92-TN的抗腫瘤活性并不顯著，終點(diǎn)腫瘤重量的減少很小。在這方面還需要更深入的研究。

展望

自然殺傷細(xì)胞是一組獨(dú)特的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，具有不受MHC限制的細(xì)胞毒性、產(chǎn)生細(xì)胞因子和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵角色。CAR-NK細(xì)胞療法是一個(gè)很有前途的臨床研究領(lǐng)域，對(duì)某些癌癥患者具有良好的安全性和初步療效。與CAR-T細(xì)胞相比，CAR-NK細(xì)胞具有自己獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，但仍面臨著一些挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括細(xì)胞增殖的改善，使細(xì)胞毒性的激活更有效，以及最終找到NK細(xì)胞的最佳重建方法。相信解決好這些問(wèn)題，基于NK細(xì)胞優(yōu)秀的抗腫瘤血統(tǒng)，極有可能在CAR修飾的武裝下為腫瘤治療帶來(lái)新的突破。

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原文標(biāo)題?:?CAR-NK的設(shè)計(jì)和未來(lái)展望

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